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圖解|哈獸研對中國首株非洲豬瘟分離毒在豬體的復制規律和致病性研究

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  • 日期:2019-03-27
  • 編輯:lily
  • 來源:中國動物保健
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研究組給不帶任何病原的豬肌注接種不同劑量Pig/HLJ/18后,2~3天血液病毒核酸檢測陽性,3~4天出現發熱等癥狀,4~5天口腔及肛拭子樣品病毒核酸檢測陽性,6~10天內接種豬全部發病死亡;病死豬剖檢一般表現為急性出血性變化,部分脾臟極度腫大,難以與其他急性出血性疾病區別。而且,所有發病死亡豬體內均可檢測到高水平ASFV載量。以上研究結果證明,我國ASFV流行病毒株感染豬能引起高度急性病程,具有高度的致病性和傳染性。

中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所國家非洲豬瘟專業實驗室成功分離了我國第一株ASFV,對其感染性、致病力和傳播能力等生物學特性進行了較為系統的研究,并建立了動物感染模型;初步闡明了我國ASFV流行毒株的基因組特點和進化關系,為我國ASF疫情的有效防控提供了重要科學依據,為檢測技術和防治疫苗研發奠定了重要基礎。相關研究結果發表在新發傳染病專業期刊《Emerging Microbes and Infections》。

趙東明、劉任強等人利用2018年9月3日黑龍江省佳木斯疫情發病豬樣品,接種豬原代肺泡巨噬細胞,成功分離出我國第一個ASFV毒株(Pig/HLJ/18)。

中國的生豬產量約占全球總產量的50%。自2018年8月非洲豬瘟病毒(ASFV)進入中國以來,該病毒已迅速擴散至中國全境,嚴重威脅了中國的生豬養殖業。本研究利用原代豬肺泡巨噬細胞從ASFV暴發豬場的樣本中分離到ASFV 毒株Pig/Heilongjiang/2018 (Pig/HLJ/18),并采用紅細胞吸附實驗(HAD)、蛋白免疫印跡、免疫熒光和電鏡技術對該毒株的特性進行了研究。針對ASFV p72基因的進化分析顯示,Pig/HLJ/18為基因2型。病毒在原代巨噬細胞和骨髓巨噬細胞的效價可達107.2 HAD50/ml。肌肉接種103.5–106.5 HAD50不等劑量的SPF豬可出現高熱、出血等急性癥狀。接種豬的潛伏期為3-5天,在接種后6-9天死亡;接觸豬的潛伏期則為9天,在接觸后的13-14天死亡。接種豬在接種后第二天出現病毒血癥,接觸豬的病毒血癥則出現于第9天。口腔和直腸拭子分別在在接種后2-5天和接觸后6-10天可檢出病毒DNA。上述結果說明Pig/HLJ/18對豬具有高度致病性和快速傳播能力。ASFV危脅極大,其控制和清除工作十分必要。

圖1. 田間脾臟樣本中對ASFV的檢測。(A)對疑似感染豬脾臟DNA的PCR檢測。第一泳道為樣品,第二泳道為陽性對照質粒;第三泳道為陰性對照。(B)脾臟勻漿的紅細胞吸附分析。脾臟勻漿上清被稀釋10倍后接種豬PBMC細胞,添加1%豬血細胞。紅細胞吸附觀察期為7天。

圖2. 病毒在原代豬肺泡巨噬細胞上的復制。原代豬肺泡巨噬細胞接種MOI=0.2劑量的Pig/HLJ/18 ,細胞上清被用于(A)感染性病毒顆粒的檢測和(B)p72基因的定量。原代豬肺泡巨噬細胞感染Pig/HLJ/18后被裂解,產物用于病毒p30蛋白的檢測(C)和免疫熒光分析(D)。細胞上清中的病毒顆粒被負染后用于電鏡觀察(E),感染后48H的細胞被用于超薄切片觀察。

圖3. 針對Pig/HLJ/18 p72基因的進化分析。ASFV參考毒株的p72基因序列下載于NCBI數據庫。該圖基于鄰接法由MEGA X軟件繪制。每個分支上的數字顯示Bootstrap值>70%。本研究的ASFV分離毒為黑色菱形標記。白色三角代表中國首個案例的ASFV序列。比例尺為每個位點的核苷酸替換數。

圖4.Pig/HLJ/18 感染豬樣本的病毒基因組拷貝數。血液、口腔拭子和直腸拭子于指定時間收集于接種劑量為103.5 HAD50 的三頭感染豬。病毒p72基因的拷貝數由熒光定量方法測定。黑色虛線代表未感染組的檢測極限。

圖5. HAD分析所測得的血液和器官中的病毒滴度。血液收集于不同接毒劑量的接種豬(A-D)和接觸豬(E-F)。(A) 106.5 HAD50劑量接種豬; (B) 105.5HAD50劑量接種豬; (C) 104.5劑量接種豬; (D) 103.5HAD50劑量接種豬; (E)104.5HAD50劑量接種豬的接觸豬; (F)03.5HAD50劑量接種豬的接觸豬。(G)接種豬和接觸豬肝臟和脾臟中的病毒滴度。樣品收集于剖檢時,每頭豬的病毒接種劑量顯示于每個圖的上方。 

圖6. 接觸豬樣本的病毒基因組拷貝數。血液、口腔拭子和直腸拭子于指定時間收集于兩頭接觸豬,這兩頭豬分別與接種劑量為104.5 HAD50和104.5 HAD50接種豬同居。黑色虛線代表檢測極限。

圖7. 死于Pig/HLJ/18 感染的豬的臟器損傷。所有豬的損傷在附表中進行了概述。106.5HAD50接種劑量豬的心、肺、膽、脾、腸系膜淋巴結和胃肝損傷如圖所示。(A)心外膜嚴重彌漫性出血(B)輕度肺間質水腫,插入物是對框架區域的放大(C)膽囊壁和肝臟嚴重出血、水腫,插入物是對圓形區域的放大(D)脾臟嚴重腫大、易碎、呈暗黑色(E)腸系膜淋巴結輕度腫大,外觀紅黑(F)胃肝淋巴結腫大出血

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